Kỹ thuật PCR (viết tắt của Polymerase chain reaction) là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm ADN và sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của một trình tự ADN cụ thể.

Thông qua PCR, một đoạn ADN với lượng rất nhỏ (chỉ vài nanogram) có thể được khuếch đại theo cấp số nhận để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN đó.

PCR hiện là một kỹ thuật cơ bản quan trọng và thường không thể thiếu được trong quy trình nghiên cứu của các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử, y sinh, khoa học hình sự, pháp y và xét nghiệm ADN.

PCR được phát minh bởi TS. Kary Mullis vào năm 1983. Vào thời điểm đó, ông đang làm việc tại Cetus Corporation, một trong những công ty công nghệ sinh học đầu tiên. Công trình của Kary Mullis đã vinh dự được nhận giải Nobel về Hóa học vào năm 1993 cùng với Michael Smith.

Nguyên lý kỹ thuật PCR

PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của enzyme DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN mới từ chuỗi ADN ban đầu được cung cấp.

Bởi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào nhóm 3′-OH có từ trước, nên enzyme này cần một đoạn ADN mồi để có thể thêm nucleotide đầu tiên.

Yêu cầu này cho phép phân định một vùng cụ thể của chuỗi mẫu mà nhà nghiên cứu muốn khuếch đại. Khi kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ được tích lũy thành hàng tỷ bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu.

Thành phần của một phản ứng PCR thường bao gồm:

1. Dung dịch ADN mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản.
2. Primers: là các đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kb, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu.
3. DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase.
4. Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) –> là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của ADN –> DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao.
5. Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase
6. Ống PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler)

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm 6 bước chính:

• Initialization: hỗn hợp dung dịch PCR được gia nhiệt lên đến 94–98 °C trong thời gian 1-10 phút để làm nóng
• Denaturation: đoạn trình tự ADN sợi đôi được làm nóng và phân tách thành 2 sợi ADN đơn, tạo khuôn cho quá trình nhân bản
• Annealing: các đoạn mồi bám vào sợi ADN khuôn tại vị trí khởi đầu để bắt đầu quá trình tổng hợp sợi ADN mới
• Extension/elongation: enzyme Taq polymerase sẽ tham gia hoạt động tổng hợp bằng cách sử dụng các dNTPs để gắn lại với nhau tạo thành chuỗi bổ sung
• Final elongation: sau khi trải qua một vòng lặp các chu trình nhiệt (25-40 vòng tùy theo thí nghiệm), phản ứng PCR tiếp tục được duy trì ở nhiệt độ 70–74 °C trong thời gian 5-10 phút để đảm bảo rằng toàn bộ các sợi ADN đơn sẽ được kéo dài hoàn toàn. Ở thời điểm này, số lượng các bản sao ADN của trình tự ADN ban đầu có thể đạt đến con số 2³⁰, or 1073741824 bản sao.
• Final hold: toàn bộ khay phản ứng PCR được làm mát ở nhiệt độ 4–15 °C trong một khoảng thời gian không xác định và có thể được xem như là giai đoạn lưu trữ ngắn hạn các sản phẩm của phản ứng PCR.

Quy trình kỹ thuật PCR thường sử dụng 6 thành phần cơ bản và trải qua 6 bước nêu trên.

Mặc dù vậy, thực tế triển khai không chỉ đơn thuần là lấy mỗi thành phần một ít và trộn đều với nhau trong ống PCR rồi cho vào máy chạy là sẽ có hàng triệu bản sao của đoạn trình tự ADN ban đầu như mong muốn.

Trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, đặc biệt là phòng xét nghiệm ADN, mỗi phản ứng PCR cần được tối ưu hóa theo các tiêu chí của công việc để có thể nhân bản được đúng trình tự ADN mong muốn với độ tin cậy cao.

>>> Xem thêm: PCR – 6 thành phần quan trọng cần hiểu cho đúng

Kỹ thuật PCR và ứng dụng

Trong quãng thời gian hơn 30 năm kể từ khi PCR được sử dụng lần đầu tiên, kỹ thuật này đã tác động mạnh mẽ đến mọi lĩnh vực chuyên ngành liên quan đến Khoa học sự sống và Y Sinh học.

Kỹ thuật PCR đã giúp làm thay đổi cách thức nghiên cứu và nâng cao năng suất làm việc của các chuyên ngành từ pháp y, an toàn thực phẩm, chẩn đoán lâm sàng cho đến nghiên cứu hệ gen (genomics).

Trên thực tế, kỹ thuật PCR đã trở nên phổ biến, đôi khi hơn cả sự tưởng tượng mà chúng ta có thể nghĩ ra. Thuật ngữ “PCR” cũng đã là một từ trong Từ điển đại học Merriam-Webster.

Trong lĩnh vực xét nghiệm ADN, kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân bản các đoạn ADN tách ra từ đứa trẻ và người cha nghi vấn. Ở bước tiếp theo, sản phẩm PCR sẽ được dùng để phân tích trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới.

Tài liệu tham khảo

• Polymerase chain reaction (Wikipedia)
• Polymerase chain reaction (NCBI)
• Polymerase chain reaction (ScienceDirect)
• PCR: Past, Present, & Future
• PCR primers (Biocompare)
• Primer Design for PCR (Addgene)
• Designing PCR primers and probes (Integrated DNA Technologies)

TS. Đặng Trần Hoàng
Viện trưởng Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền

The post Kỹ thuật PCR – Ứng dụng trong xét nghiệm ADN appeared first on NOVAGEN.

Xét nghiệm ADN là một công cụ mạnh mẽ để xác định danh tính và nhận dạng mỗi người. Với công nghệ ngày nay, các xét nghiệm ADN hiện có thể xác định các cá nhân với độ tin cậy gần như 100%.

Trong bài viết này, chúng ta sẽ cùng tìm hiểu và nhìn lại sự phát triển của công nghệ xét nghiệm ADN để thấy được tầm quan trọng và ý nghĩa của loại hình xét nghiệm huyết thống này trong đời sống hàng ngày.

Nhận dạng, tiếng Anh là “Identification”, luôn là một quá trình đầy khó khăn và vất vả đối với chuyên gia trong lĩnh vực pháp y và khoa học hình sự. Trước khi công nghệ xét nghiệm ADN xuất hiện, các nhà khoa học đã phải sử dụng nhiều kỹ thuật tương tự khác như xét nghiệm nhóm máu (blood typing), xét nghiệm huyết thanh học (serological testing) và xét nghiệm HLA (HLA testing).

Trên thực tế, những xét nghiệm liên quan đến nhóm máu rất hữu ích cho các quá trình liên quan đến ghép tạng như tìm kiếm người cho phù hợp với nhóm máu và mô của người nhận.

Tuy nhiên, độ chính xác của những xét nghiệm này chưa đủ để đưa ra kết luận về sự liên quan của các mối quan hệ sinh học (biological relationships). Hay nói cách khác, việc xét nghiệm huyết thống thông qua nhóm máu là không đủ để kết luận quan hệ huyết thống giữa hai người trong diện nghi vấn.

Và điều kì diệu đã xảy ra.

Sự ra đời của công nghệ xét nghiệm ADN vào cuối những năm 1970 và đầu những năm 1980 đã giúp các nhà khoa học nhìn thấy tiềm năng cho các xét nghiệm mạnh mẽ hơn để nhận dạng và xác định mối quan hệ sinh học. Nhờ sự ra đời của xét nghiệm ADN, giờ đây chúng ta có thể xác định chắc chắn danh tính của các cá nhân và người thân họ hàng của họ.

Các phần tiếp sau đây sẽ xem xét sự phát triển của công nghệ xét nghiệm ADN từ những ngày đầu sử dụng xét nghiệm máu cho đến khi đạt được công nghệ mới nhất trong xét nghiệm ADN.

Xét nghiệm nhóm máu

Vào đầu những năm 1920, các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu khác nhau ở người – A, AB, B và O – dựa trên sự hiện diện của một số protein gọi là kháng nguyên trong máu. Hệ thống xét nghiệm nhóm máu, được gọi là hệ thống ABO, cung cấp cho các bác sĩ thông tin quan trọng về bệnh nhân của họ, cho phép họ thực hiện các thủ tục y tế một cách an toàn như truyền máu bằng cách khớp với nhóm máu của người cho và người nhận.

>>> Xem thêm:

• Xác định huyết thống qua nhóm máu ABO
• Lý do nhóm máu AB là nhóm máu hiếm nhất thế giới

Các nhà khoa học nhận ra rằng các nhóm máu được di truyền về mặt sinh học và có thể dự đoán nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ.

Ngược lại, nếu không xác định được một trong các nhóm máu cha mẹ, người ta có thể sử dụng nhóm máu của đứa trẻ và cha mẹ đã biết để xác định nhóm máu cha mẹ bị mất tích. Tuy nhiên, vì thông tin từ việc xét nghiệm nhóm máu bị hạn chế, rất khó để xác định mối quan hệ sinh học một cách chính xác.

Ví dụ, nếu một đứa trẻ có nhóm máu A và mẹ của đứa trẻ có loại AB, thì cha đẻ của con con có thể có bất kỳ một trong 4 nhóm máu. Vì vậy, trong ví dụ này, không người đàn ông nào có thể bị loại trừ như cha đẻ của con con.

Độ chính xác của xét nghiệm máu ABO là khoảng 30%, và do vậy không thực sự hữu ích cho xét nghiệm huyết thống quan hệ cha con thông thường.

Xét nghiệm huyết thanh học

Vào năm 1930, các nhà khoa học đã phát hiện ra các protein khác trên bề mặt tế bào máu có thể được sử dụng để nhận dạng con người.

Các hệ thống nhóm máu Rh, Kell và Duffy, như hệ thống máu ABO, dựa trên sự hiện diện của các kháng nguyên cụ thể được di truyền về mặt sinh học và cung cấp thêm sức mạnh, cùng với ABO, để giải quyết các mối quan hệ sinh học bị nghi ngờ.

Tuy nhiên, xét nghiệm huyết thanh học (Serologica Test) không được sử dụng để kết luận các mối quan hệ sinh học. Lý do là độ tin cậy của xét nghiệm huyết thanh học là 40%, có nghĩa là kỹ thuật này, giống như ABO, không hiệu quả trong việc đánh giá các mối quan hệ sinh học bị nghi ngờ.

Xét nghiệm HLA

Vào giữa những năm 1970, các nhà khoa học tập trung vào việc phân loại mô tạng và phát hiện ra kháng nguyên Leukocyte ở người (Human Leukocyte Antigen, HLA), một loại protein có trong cơ thể ngoại trừ các tế bào màu đỏ.

Các tế bào trắng có trong máu được phát hiện có nồng độ cao của HLA. Người ta cũng phát hiện ra rằng có nhiều loại HLA khác nhau và các loại HLA khác nhau khác nhau giữa những người không liên quan đến sinh học.

Do tính đa dạng cao của các loại HLA giữa mọi người, nên HLA được sử dụng để trả lời các câu hỏi về mối quan hệ sinh học. Độ tin cậy của việc loại trừ xét nghiệm HLA là 80% và khi kết hợp với ABO và xét nghiệm huyết thanh học là khoảng 90%.

Mô hình thử nghiệm kết hợp này mở ra việc sử dụng xét nghiệm di truyền để đánh giá sự liên quan hoặc loại trừ một người cha nghi vấn bị cáo buộc.

Một yếu tố khiến xét nghiệm HLA trở nên khó khăn là thử nghiệm yêu cầu một lượng mẫu máu lớn phải được xét nghiệm ngay trong vòng vài ngày sau khi thu thập.

Ngày nay, các xét nghiệm HLA, ABO và huyết thanh học không được sử dụng thường xuyên để kiểm tra mối quan hệ huyết thống và đã được thay thế bằng các phương pháp phân tích ADN có độ chính xác cao hơn.

Kỹ thuật RFLP

Vào đầu năm 1980, một kỹ thuật đã được phát triển được gọi là phân tích đa hình đoạn giới hạn đoạn (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) và kỹ thuật này đã trở thành xét nghiệm di truyền đầu tiên sử dụng ADN.

Giống như HLA, ABO và xét nghiệm huyết thanh học, ADN được di truyền từ cả cha và mẹ ruột. Các nhà khoa học đã phát hiện ra các khu vực trong ADN có độ biến thiên cao (đa hình) và đặc hiệu hơn so với protein máu và HLA.

ADN được tìm thấy trong mọi tế bào trong cơ thể, ngoại trừ hồng cầu.

Những thuộc tính này làm cho xét nghiệm ADN lý tưởng để giải quyết các mối quan hệ sinh học bị nghi ngờ.

Quy trình RFLP sử dụng các enzyme giới hạn (restriction endonucleases) để cắt ADN và các đầu dò ADN được gắn nhãn để xác định các vùng có chứa VNTR (Variable Number Tandem Repeat).

Trong một thử nghiệm quan hệ cha con mà người mẹ, đứa con và người cha bị cáo buộc đã được thử nghiệm, một nửa số ADN của con phải phù hợp với mẹ ruột và một nửa sẽ trùng với cha ruột. Đôi khi, thông tin hồ sơ ADN của con có thể không khớp với bố mẹ tại một vị trí ADN (locus) duy nhất, có thể do đột biến. Khi điều này xảy ra, một phép tính được thực hiện để xác định xem sự không nhất quán di truyền quan sát được là đột biến hay loại trừ.

Độ tin cậy của xét nghiệm ADN RFLP lớn hơn 99,99%. Tuy nhiên, hiện tại xét nghiệm này không được thực hiện thường xuyên vì số lượng ADN cần thiết để xét nghiệm (khoảng 1 microgam), yêu cầu lấy mẫu máu và thời gian quay vòng dài cần thiết để xét nghiệm (10 – 14 ngày).

Kỹ thuật PCR

Vào đầu những năm 1990, xét nghiệm DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction, PCR) đã thay thế phân tích RFLP để kiểm tra mối quan hệ huyết thống.

Kỹ thuật PCR đòi hỏi ít ADN (1 nanogram) vì vậy chỉ cần một miếng gạc má (buccal) quẹt vào khóe miệng phía trong thành má là đã đủ ADN để làm xét nghiệm. Việc tách chiết ADN từ niêm mạc miệng đã trở thành một mẫu thích hợp để thử nghiệm, do đó loại bỏ sự cần thiết của việc lấy máu.

Kỹ thuật PCR nhanh hơn nhiều so với kỹ thuật RFLP, kết quả có trong vòng một ngày kể từ khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm.

PCR nhắm mục tiêu các khu vực trong ADn được gọi là STRs (Short Tandem Repeats) có độ biến thiên cao. Trong xét nghiệm quan hệ cha con, người mẹ, con và người cha bị cáo buộc được xét nghiệm, ADN của con phải trùng khớp với cả cha mẹ ruột trừ khi có đột biến.

Các tính toán thống kê có thể được thực hiện để giúp xác định xem sự không nhất quán di truyền tại một vị trí gen (locus) có phù hợp với đột biến hoặc loại trừ hay không. Đôi khi có nhiều hơn hai đột biến được quan sát và trong những trường hợp đó, xét nghiệm bổ sung cần được thực hiện.

Độ chính xác của xét nghiệm PCR là lớn hơn 99,99%

Kỹ thuật SNP Arrays

Vào đầu những năm 2000, các nhà khoa học đã có thể kết hợp hàng ngàn locus SNP (Single Nucleotide Polymorphism) vào một thử nghiệm duy nhất. SNP là những thay đổi chữ cái trong ADN có thể được sử dụng làm dấu hiệu di truyền cho nhiều ứng dụng khác nhau.

SNP arrays không được sử dụng phổ biến để kiểm tra mối quan hệ nhưng được sử dụng cho một số xét nghiệm di truyền khác bao gồm; khuynh hướng bệnh di truyền, sức khỏe và sức khỏe và tổ tiên.

SNP arrays chứa thông tin về các dấu hiệu của tổ tiên (Ancestry Informative Markers, AIMs ), dấu hiệu nhiễm sắc thể Y (Y-Chromosome markers), dấu hiệu ty thể (mitochondrial markers), dấu ADN cổ đại và các dấu hiệu khác hữu ích để thiết lập mối quan hệ sinh học xa hơn như anh em họ hàng đời thứ 4 hoặc thứ 5.

Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới NGS

Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới – NGS (Next Generation Sequencing), hoặc còn gọi là giải trình tự song song lượng lớn (Massively Parallel Sequencing) là kỹ thuật mới nhất hiện nay dùng trong phân tích di truyền.

Quy trình này tạo ra một chuỗi trình tự ADN là sự sắp xếp tuyến tính của các chữ cái (A, T, C và G) xảy ra trong mẫu ADN.

Bởi vì kỹ thuật này cho phép một người đồng thời bắt đầu giải trình tự tại hàng ngàn vị trí trong ADN trùng nhau, nên có thể tạo ra một lượng lớn dữ liệu và kết hợp lại với các chương trình tin sinh học thích hợp. Nó sẽ giống như lấy sách và cắt các phần của câu sau đó ghép lại cuốn sách bằng chương trình máy tính để nhận ra các đoạn câu chồng chéo.

>>> Xem thêm: Giải trình tự gen thế hệ mới là gì?

Bằng cách sử dụng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, xét nghiệm quan hệ cha con trước sinh không xâm lấn (NIPP) có thể xác định cha đẻ của thai nhi ngay sau 7 tuần thai bằng cách sử dụng mẫu máu từ mẫu tế bào mẹ và tế bào má từ người cha có thể.

Đặc biệt, hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới hiện tại đã và đang được nhiều Trung tâm xét nghiệm ADN tại Việt Nam sử dụng, trong đó có Trung tâm NOVAGEN.

Vì vậy, các xét nghiêm ADN Cha Con trước sinh bằng cách lấy mẫu máu tính mạch của mẹ mang thai ở từ tuần thứ 7 giờ đây không phải gửi mẫu sang Mỹ hay Hồng Kong nữa, mà với công nghệ xét nghiệm ADN hiện tại, các nhà khoa học tại Trung tâm xét nghiệm ADN NOVAGEN hoàn toàn có thể thực hiện ngay tại Việt Nam với thời gian trả kết quả là trong 7-10 ngày làm việc.

>>> Xem thêm: Xét nghiệm ADN trước sinh

BẢNG GIÁ XÉT NGHIỆM ADN TẠI HÀ NỘI

Tài liệu tham khảo

• History of DNA Testing
• DNA paternity testing
• DNA profilling
• RFLP and the DNA Analysis Applications

TS. Đặng Trần Hoàng
Viện trưởng Viện Công nghệ ADN và Phân tích di truyền

The post Sự phát triển của công nghệ xét nghiệm ADN appeared first on NOVAGEN.